定量限(分析方法验证的统计学评价：检测限，定量限和性线)

在新药申报资料中，药品质量控制部分包括质量标准、放行检测数据、分析方法、分析方法验证和质量标准接受限度的说明，其中分析方法验证是最基本的组成要素，它影响着分析数据的可靠性和一致性。

对于分析方法验证需进行的检测项目和验证指标，ICH Q2(R1）、ChP2020 <9101>分析方法验证指导原则和USP<1225>分析方法验证通则都有明确的规定，如ChP2020<9101>分析方法验证指导原则中规定根据检验项目的不同，视具体情况列出了验证的指标，如专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。

一、检测限和定量限

设备和检测过程都存在误差，实际上检测结果是离散值，而非连续值。因此有必要去测试设备最小精度和可以测量准确的精度。

• 检测限是指样品中被测物能被检测出的最低量。检测限仅作为限度试验指标和定性鉴别依据。定量限指被检测物能被定量测定的最低量。

常用的测试方法有直观法、信噪比法和线性法。

1. 直观法

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出或定量出的最低浓度或量。

1. 信噪比法

用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度样品检测出或定量出的信号与空白样品测出的信号比较，计算出能被可靠地检测出或定量出的最低浓度或量。检测限一般以信噪比3:1, 定量限为10:1.

1. 线性法

按LOD（检测限） = 3.3，LOQ（定量限）= 10公式计算。为响应值的偏差：S为标准曲线的斜率

δ有两种测得方法：（1）测定空白样品信号值的标准偏差；（2）标准曲线的剩余标准偏差或是截距的标准偏差。

基于线性的测量方法相对于信噪比法，避免了人为选择噪音部分，同时考虑了多次进样分析之间的差异，结果更为可靠。

• 可检测性

USP PF39 <1200>中有提到用被测物的可检测性来取代现有的验证参数检测限和定量限。

a: 配制一个在限度浓度的杂质标准品溶液

b: 配置一个添加了在限度浓度的杂质标准品的样品标准品溶液

c: 配置一个添加了（限度100%-%RSD*浓度）的杂质标准品的样品标准品溶液

*由下图1 Horwitz方程估算得出

如果a b且c < 2, 测差异可被检测出，否则该方法不能胜任限度的检测。

图1. Horwitz方程重复性和回收率变异度接收标准

• 统计学评价

“检出”是指可判定被测试样中存在待测物质的浓度（或质量）高于其空白值。由于测量值是以概率取值的随机变量，测量值的分布具有统计性。因此样品中检出待测物质的最小浓度是指在一定置信水平下判定样品中存在待测物质。

检测限（LOD）估算是基于国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）和ISO的定义，引入了假阳性和假阴性决策。LOD值依赖于实验室能力。

首先定义一个临界值Rc，该值为空白样品在超过读数，

Rc = B + Z1-asE，等式1;

Rc: 空白样品在超过读数;

B: 空白样品的估计平均读数；

Z1-a正态分布分位数，左侧1−a区域；

sE：空白值的标准偏差

如果a = 0.05, 1- a = 0.95, Z0.95 = 1.645 通过Excel函数 “=NORMINV(0.95,0,1)”得到。

得到的判定是基于空白样品值的统计分布。

LOD为信号区间（RD）中的值，该值以超过（1-b）概率Rc的值，

RD = RC + Z1-bSE，等式2

RD: LOD信号区间中的值;

RC: IUPAC/ISO中定义LOD的临界值；

Z1-b正态分布分位数，左侧为（1−b）区域；

SE：空白值的标准偏差

将等式1与2合并得到，

RD = B+

等式中出现的a为第一类错误的概率（假阳性错误概率），b为第二类错误的概率（假阴性错误概率），如下图:

当a = b = 0.05, = 1.645, 则RD = B+ 3.3SE

LOD，通常是通过信号响应值RD转化成对应的浓度值，如图2：

响应值对应浓度值的回归曲线为R = B+ mX,

R: 响应信号值；

B：空白平均读数；

m: 回归曲线斜率

X：被测样品浓度值

当X代表LOD时，此时R为RD，则LOD =

，等式3

正态分布分位数，左侧1−a区域；

正态分布分位数，左侧为（1−b）区域；

：空白值的标准偏差

当a = b = 0.05, = 1.645, LOD =

.

作为统计学评价过程，通常是未知的，且它为浓度依赖型数据，使得估算过程更为复杂。

有两个估算方法：a: 为空白样品响应值的标准偏差; b: 从浓度与响值值回归方程的偏差得到标准偏差，选择最能代表LOD的标准偏差值。

由于实验室经常选择一个最坏情况下的标准偏差，如果LOD仍然适用于其预期用途，实验室将受到保护，防止低估LOD。低估LOD会导致夸大第二类错误率（b）和减小I类错误率（a）。

二、线性

线性是指在实验设计的范围内，试验结果与样品中被测物浓度之间的比例关系的能

力。

方法验证需要进行线性的考察，数据参数有回归方程、相关系数、残差平方和，线性图等模型。线性关系是一种统计函数关系，是一种数理统计方法，使用到了最小二乘法进行了线性回归计算。

1. 线性曲线的统计学评估

对于一般y随x变化的线性关系表示为：

a为回归线在纵坐标上的截距；

b为回归线的斜率，表示y随x变化所引起的变化率；

为实验过程中其他随机因素引起的随机误差。

线性关系的其他参数：

相关系数r为变量x与y间的相关性，一般来说r<0.3, 为弱相关；r>0.8为强相关；

剩余方差：指真实值y与理论值y间的差距。

方法1：回归方程统计学评价

例1: 随机得到一组数据，分别为浓度(X)和峰面积(Y)，如下表所示：

Excel 软件，插入这一组数据的散点图，添加趋势线，对这两组数据进行回归分析计算，得到X与Y间的线性统计量：y = 1.0291x - 0.2521, R² = 0.9984; X与Y之间的标准误差使用 Excel软件中的函数STEYX可以计算得到为0.1704。

上述数据对X与Y间的关系进行了简单的分析与判断，无法进行更多的统计学评价。

方法2:方差与置信区间的统计学分析

要进行两者关系的方差分析与区间分析，可以利用EXCEL软件中的宏文件分析工具，示意如下：

选择EXCEL的数据分析®回归，选择对应的数据区域，勾选标志、置信度、残差、标准残差等参数，确认得到结果。

结果分析如下：

a. 回归分析

结果表明，有99.8%的Y变异与X相关。浓度X的变化会引起峰面积99.8%的变化率。标准误差表示在测试中有0.1704的噪音，它是由外界环境、人为等操作原因导致的。如果这个值较大，说明误差较大，数据的准确度不高。

b. 方差分析：

Significance F<0.05, 说明模型在统计学上是显著的，线性在统计学上是成立的。反之F>0.05, 则说明线性在统计学上不成立。

c. 置信区间：

• Coefficients为线性系数a, b值。第一行为线性方程的截距，第二为线性方程的斜率。假如 ，则a= - 0.2520, b = 1.0291;
• 标准误差表示为计算a, b时在实验条件下的计算误差；
• P-value，第一行P>0.05, 表示b值过原点，标准误差0.2149只是代表测量误差。斜率p<0.05, 表示斜率有统计学意义。
• 95%置信区间，代表a, b的置信区间。该值可以用来判断多次线性是否发生变化。如果置信区间不变，说明多次线性是一致。

d. 标准误差分析：

标准误差是指无法准确测试的那一部分数据，即噪音。标准残差可以看作为标准误差的观测值。一般可以用标准误差来估算定量限和检测限。即10´标准误差/斜率公式计算定量限，3´标准误差/斜率计算检测限。标准误差还可以用来评估离群值。

当标准残差绝对值大于2时，说明该测试点异常。

2. 两条回曲线的比较

在分析实践中，遇到同一台仪器在不同时间，或不同人员用相同方法对同一测量对象测量得到两条回归直线不一定相同，包括两条回归直线的标准差不同，或斜率不同，或截距不同。那么如何判断两条回归直线之间是否有显著性差异，两条回归直线是否可以合并后计算测量结果。我们可以用F检验来判断两条回归直线是否一致。

• 方差分析检测两回归直线的方差是否有显著性差异。

假设两条回归直线为：

用F检验检查两回归线是否有显著性差异，统计量为：

S1､S2为两条回归直线的标准偏差。、为两回归直线的方差。标准偏差可以通过前述方法2中EXCEL软件计算得到。通常将小的方差设为分母，方差分析的自由度为n-2，计算得到F值，与F0.05(n1-2, n2-2)对比，如F< F0.05(n1-2, n2-2)，则表明两直线间无显著性差异，可以合并使用。

• 置信区间

将两条回归直线中的一条作为基准，通过方法2计算得到回归直线的置信区间，如果另一回归直线的截距和斜率都在基准回归直线的置信区间内，则认为两回归直线是一致的， 则可以将两条直线拟合成一条直线。

三、结束语

本文讨论了方法验证中检测限、定量限和线性的一些常见统计学指标及统计学评价方法。分析测量不确定度与分析方法密切相关，检测限与定量限是衡量方法灵敏度的指标，线性是评估结果与样品浓度的函数关系。

参考文献

1. USP PF39(5) <1200>: Requirements for Compendial Validation

2. USP <1210>: Statistical Tools for Procedure Validation

3. USP <1225> Validation of Compendial Procedures

4. 中国药典2020<9101>：分析方法验证指导原则

5. USP <1010>: Analytical Data - Interpretation and Treatment

6. 药物杂质分析，胡昌勤，2015

7. 分析测试统计方法和质量控制，曹宏燕

转载自：文亮频道