m6a甲基化(m6A甲基化修饰，怎样在人类病毒感染复制中起作用？)

文 | 十一情报局

编辑 | 十一情报局

RNA的甲基化修饰是影响基因功能的重要因素，甲基化修饰包括多种形式。

其中6-腺苷酸甲基化(m6A)，1-腺苷酸甲基化(m1A)和5-胞嘧啶甲基化(m5C)修饰目前研究较为清晰，而m6A修饰是高等生物mRNA上最为普遍的修饰。

m6A修饰主要集中在RNA的终止密码子附近及3端非翻译区，其碱基序列特点为[G/A/U][G>A]m6AC[U>A>C]。

病毒感染是影响人类健康的重要因素，病毒的复制依赖于靶细胞，而靶细胞会启动清除病毒的机制。

研究发现，在病毒感染复制过程中，病毒和宿主RNA的m6A修饰水平均会发生改变，这些变化影响病毒的复制和靶细胞的状态。

而且不同种类的病毒感染中，m6A修饰发挥的作用不尽相同，m6A修饰在病毒复制过程中调控机制的研究表明。

m6A修饰对于病毒复制的调控是通过影响病毒mRNA或基因组RNA的稳定性来实现的。

而m6A修饰对宿主的影响在一定程度上与宿主的免疫系统有关。

●—≺m6A修饰概述≻—●

m6A修饰是指RNA分子腺嘌呤第6位N处发生甲基化，广泛存在于自然界中，包括哺乳动物、植物、昆虫以及微生物等。

其修饰过程主要在以下几种酶的作用下完成：甲基转移酶复合物(writers)、去甲基化酶(erasers)和阅读蛋白(readers)。

这三者共同调控RNA的m6A修饰水平，最终影响相关基因的功能。

目前研究较清晰的甲基转移酶复合物包含甲基转移酶样3/14和wilms肿瘤蛋白1相关蛋白。

METTL3/14主要定位在细胞核中，均包含S-腺苷硫氨酸(SAM)结合位点和具有催化作用的DP-PW结构域。

二者高度同源，相互结合形成甲基转移酶复合物。

在催化过程中METTL3充当催化亚基，而METTL14则提供RNA结合支架，激活并增强METTL3的催化活性，协同增强催化作用提高甲基化修饰水平。

WTAP没有催化活性，但能稳定核心复合物，促进METTL3-METTL14复合物定位于富含mRNA剪切因子和出核转运因子的核斑，以调节RNA转录的m6A水平。

近年来又发现了一系列m6A甲基转移酶复合物的新组分，包括KIAAl429、RBMl5、HAKAI和METTLl6。

甲基转移酶成员的不断增加，提示m6A甲基化是一个复杂且重要的RNA修饰，对其进行研究将有助于理解RNA的调控机制。

FTO是第一个被发现的去甲基化酶，属于非血红素Fe(II)和α-KG依赖性双加氧酶ALKB蛋白家族的成员之一。

在FTO上含有Fe2+和α-酮戊二酸的结合位点。

两者共同作用能够将m6A氧化为N6-羟甲基腺苷(hm6A)以及N6-甲酰腺苷(f6A)，有效去除细胞内以及体外RNA的m6A甲基化修饰。

AlkB同源物5(AlkBhomolog5，ALKBH5)是第二个被发现的去甲基化酶，ALKBH5只对单链RNA上的m6A具有去甲基化作用。

与FTO不同的是，ALKBH5在行使功能时并未形成中间产物，而直接将m6A逆转为腺苷，从而达到去甲基化的效果，去甲基化酶的发现证明甲基化修饰是一个可逆的过程。

阅读蛋白在m6A修饰过程中也发挥重要作用，这些蛋白可以调节靶RNA的稳定性、剪接效率、多聚腺苷酸化、核输出和翻译效率等。

阅读蛋白主要包括YTH(IYT521-Bhomology)结构域蛋白、核不均一核糖蛋白(hnRNP)、胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白(IGF2BP)以及真核起始因子(eIF)。

YTH结构域是阅读蛋白的重要标志，目前发现的含有YTH结构域的阅读蛋白主要有YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2五种类型。

YTHDF1-3主要在细胞质中特异性识别m6A修饰位点，而YTHDC1-2作用部位在细胞核，能够通过与多种剪接因子的互作，调控mRNA的剪接。

hnRNP除了激活miRNA初级体(pri-miRNA)下游通路外还与miRNA前体(pre-miRNA)加工有关。

IGF2BP采用m6A依赖性方式来提高目标mRNA的稳定性和贮存，eIF能够与RNA5'端UTR上发生m6A修饰的碱基相结合，从而促进mRNA的翻译。

病毒感染靶细胞后会利用细胞的资源和系统进行复制，合成病毒基因RNA或者DNA，然后转录成mRNA并进一步翻译合成病毒蛋白，最终组装新病毒分泌到细胞外。

同样地，病毒RNA也会被宿主细胞内m6A甲基化修饰系统所调节，使病毒复制受到干扰。

同时，病毒的一些蛋白可以与m6A甲基化修饰相关因子相互作用，抵御宿主基因的免疫功能，确保病毒复制及参与到病毒的致病过程中。

甲型流感病毒是一种分节段的负链RNA病毒，其基因组由PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS8个片段组成。

IAV是常见流感病毒，感染后可引起急性呼吸道传染病，对人类公共健康构成威胁，IAV是第一个在病毒RNA中发现m6A修饰的病毒。

IAV转录基因组包含24个m6A位点，其中NA基因有7个，HA基因有8个，具有较高水平的甲基化修饰。

METTL3基因敲除后病毒复制受到抑制，在A549细胞中，METTL3的突变失活抑制IAV复制，而YTHDF2的异位过表达增强IAV复制和感染性颗粒产生，加入m6A抑制剂3-去氮腺苷(DAA)可以抑制IAV基因的表达和病毒RNA复制。

DAA通过消耗细胞内甲基供体s-腺苷甲硫氨酸(SAM)的水平来抑制m6A修饰，提示m6A修饰水平的降低可抑制病毒的复制，YTHDF2过表达后病毒基因的表达和复制增加。

而YTHDF1/3对病毒的复制没有明显影响，研究表明m6A对IAV基因表达和病毒粒子生成有促进作用，这些发现增加了对IAV中m6A修饰的理解。

乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，主要通过一种被称为前基因组RNA(pgRNA)的中间体来完成生命周期。

HBV感染是慢性肝炎的主要原因，并有发展为肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)的风险，HBVmRNA的m6A甲基化修饰，位于其3’端、pgRNA的5’端和3’端的ε茎环上，旨在调节HBV的生命周期。

其中，pgRNA的5’端m6A修饰可以正向调控转录过程，而其3端的m6A修饰位点可破坏转录本的稳定性，表明m6A对HBV具有双重调节作用，修饰水平和位点的改变会不同方向地影响HBV复制。

敲低METTL3/METTL14明显降低HBVmRNA中m6A的水平，并增加HBsAg、HBcAg的表达及稳定性。

相反，敲低FTO/ALKBH5可减少HBV蛋白的产生，表明m6A在HBVmRNA上的存在会降低RNA稳定性和病毒蛋白质的产生。

YTHDF2能够与RIG-I竞争性结合HBVmRNA的m6A位点，降低YTHDF2表达能够增加HBVmRNA与RIG-I的相互作用。

另外，YTHDF2通过将核酸外切酶(ISG20)招募到HBVpgRNA的m6A位点以增强其抗病毒活性。

此外，HBV感染还可增强PTENmRNA的m6A修饰，导致其不稳定和蛋白质表达下降，同时抑制IFN信号转导，促进HCC的发生。

以上研究提示，HBVmRNA受宿主m6A修饰系统的影响，修饰水平的增加降低病毒的复制水平。

病毒和细胞转录本的m6A修饰是HBV病毒复制的重要调节因子。

更为重要的，HBVRNA的m6A修饰可能是病毒免疫逃逸的主要手段之一，有助于病毒的持续性感染。

●—≺m6A修饰影响≻—●

细胞因子水平当机体检测到外来微生物的蛋白、核酸及其他成分后。

信号通路由PRRs激活并驱动细胞因子的产生，进一步启动抗病毒反应并诱导适应性免疫应答，病毒RNA通过调节免疫反应通路中信号分子的产生(如TBK1、TRAF2、TRAF3等)激活固有免疫反应。

研究表明，m6A修饰在此过程中发挥重要作用，在小鼠的巨噬细胞中，MAVS、TRAF3和TRAF6的转录本具有m6A修饰。

RNA解旋酶Dead-Box46(DDX46)可以在病毒感染后与这些mRNA结合，招募m6A去甲基化酶ALKBH5，使这些转录本去甲基化。

去甲基化后的mRNAs越来越多地保留在细胞核中，抑制了信号传导和IFN的产生，阅读蛋白YTHDF2可以抑制内毒素诱导的炎症反应。

内毒素通过TLR4信号激活核因子KappaB(NF-κB)和丝裂原激活的蛋白激酶信号，表明m6A修饰可以通过调节信号分子的表达来激活抗病毒信号通路，增加细胞因子的产生，诱导炎症反应的发生。

病毒感染过程中产生的细胞因子会影响免疫细胞的成熟和激活，m6A还可以调节病毒感染细胞和免疫细胞之间的通讯。

树突状细胞是一类在连接天然免疫反应和获得性免疫反应中起重要作用的抗原提呈细胞，已有证据表明m6A可以调节DC的成熟。

使用小鼠DC细胞，发现METTL3促进DC成熟的方式依赖其对m6A修饰的催化活性，可能是通过促进m6A修饰的CD40和CD80转录本和TIRAP的翻译。

而TIRAP是TLR4/MyD88途径中的一种信号蛋白。

因此，它的表达对TLR4信号和下游DC激活具有重要意义，而CD40和CD80是共刺激分子，识别T细胞激活的第二信号。

缺乏METTL3的DC缺乏促进T细胞增殖的能力，表明m6A在DC的成熟和抗原提呈中具有重要作用。

METTL3基因敲除的小鼠中T细胞缺乏增殖和分化为效应性T细胞的能力，证明m6A修饰在T细胞的动态平衡和分化过程中必不可少。

这些工作表明m6A修饰对病毒感染后宿主的免疫响应、调节免疫细胞功能具有重要意义。

除了诱导免疫反应外，病毒感染还可以诱导细胞应激反应，从而影响细胞的新陈代谢。

黄病毒科RNA病毒感染改变了特定细胞mRNA的m6A修饰，包括RIOK3和CIRBP等，依赖于先天性免疫感应和内质网(ER)应激途径。

在病毒感染过程中，RIOK3的m6A修饰可促进其翻译，而CIRBP的m6A修饰减少可促进选择性剪接。

研究表明，病毒感染激活的内质网应激反应参与了RIOK3或CIRBP中m6A的变化，提示病毒感染诱导的先天免疫应答和内质网应激导致宿主mRNA甲基化修饰水平的改变。

内质网应激是否诱发了先天免疫反应从而被m6A调控以应对病毒感染仍有待探索，多种病毒扰乱m6A机制的表达。

其中包括人巨细胞病毒，它增加了m6A的丰度，肠道病毒71增加了METTL3和METTL14的表达，并改变了阅读蛋白、甲基化酶和去甲基化酶的亚细胞定位。

研究发现在小鼠VSV感染期间，ALKBH5的去甲基化活性被削弱，增加了参与柠檬酸循环的氧戊二酸脱氢酶(OGDH)mRNA的m6A修饰，降低其mRNA的稳定性，导致病毒复制必需的代谢产物亚甲基丁二酸的产量降低，最终抑制病毒复制。

这些结果表明，在病毒感染期间，m6A与细胞代谢发挥协同作用，为病毒性疾病的干预与治疗提供潜在药物靶点。

●—≺小结≻—●

在不同的细胞模型中，m6A相关调节因子对同一病毒的复制影响具有相互矛盾的结果，而且对不同病毒的复制也具有完全相反的调节作用，更明确的结论需要未来实验进一步验证。

病毒蛋白也可以反过来通过影响m6A修饰调节因子而调节宿主m6A的修饰水平，从而最终影响病毒的复制及致病性。

因此，研究m6A修饰的调控对筛选病毒与宿主相互作用的下游靶标具有重要意义，能为后续抗病毒药物的研发提供帮助。

另外，m6A修饰在病毒生命周期中发挥重要作用，开发靶向m6A调节因子抑制剂可作为新的治疗方法来达到抗病毒目的。

目前主要运用高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用(LC-MS)等技术手段来检测m6A水平，具体方法包括GLORI、LC-MS/MS等。

m6A修饰与病毒感染相关性的研究鲜有报道，不同病毒感染后准确定位m6A的修饰靶点，可为开发新的抗病毒药物提供理论基础。